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非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒操作步驟

  獸用

【獸藥名稱】

通用名稱：非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒

漢語拼音：Feizhou zhuwenbingdu Yingguang PCR Jiance Shijihe

英文名稱：African Swine Fever Virus Real-time PCR Detection Kit

商品名稱：無

【主要成分與含量】

【作用與用途】  用于血液、血球粉、淋巴結(jié)、脾臟、扁桃體中非洲豬瘟病毒核酸的檢測。

【用法與判定】

1 用法

1.1 樣品處理

血液樣品直接用；淋巴結(jié)、脾臟、扁桃體樣品，用無菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品2.0 g于研缽中充分研磨，再加10.0 mL PBS（pH 7.2，含1萬單位青霉素和1萬單位鏈霉素）用MixMax漩渦振蕩器混勻（樣品不足2.0 g按1:5比例加PBS），對處理的待檢樣品置70℃，30分鐘滅活后，3 000 r/min，4 ℃離心5分鐘，取上清液，編號備用；血球粉處理同上，只不過省掉研磨步驟。

1.2 樣品存放

采集或處理好的樣品在2℃～8℃條件下保存應(yīng)不超過24 h；若需長期保存，須放置-80 ℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（凍融不超過3次）。

1.3 操作步驟

1.3.1 病毒DNA的提取（使用A盒）

（1）待檢樣品、陽性對照和陰性對照的份數(shù)總和用n表示，取n個滅菌的1.5 mL離心管，逐管編號。

（2）每管加入Buffer A 500 mL。

（3）每管分別加入已處理的待檢樣品、陽性對照、陰性對照各200 mL，充分混勻，室溫放置10分鐘。

（4）取與上述離心管等量的DNase-Free吸附柱和收集管，編號。將離心管中的溶液轉(zhuǎn)移至DNase-Free吸附柱，（為避免堵塞吸附柱，盡量不要吸懸浮雜質(zhì)）。

（5）用TH-15高速離心機設(shè)置13000 r/min室溫離心30秒。

（6）棄去收集管液體，將吸附柱放回收集管中。

（7）吸附柱內(nèi)加入600 μL Buffer B，13000 r/min離心30秒。

（8）棄去收集管液體，將吸附柱放回收集管中。

（9）重復(fù)步驟（7），（8）。

（10）13000 r/min空柱離心2分鐘，去除殘留液。

（11）將每個吸附柱分別移入新的1.5mL離心管中，向柱中央加入50 μL Buffer C，室溫靜置1分鐘，13000 r/min離心30秒，離心管中液體即為模板DNA。獲得的DNA溶液，冰上保存?zhèn)溆茫ㄗ⒁馓崛〉?/span>DNA須在2 h內(nèi)進行PCR 擴增，若需長期保存須放置-80 ℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融）。

1.3.2 熒光PCR擴增（使用B盒）

（1）從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液、Taq酶，室溫融化后，2 000 r/min離心5秒。設(shè)所需PCR管數(shù)為n（n = 樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照），每個測試反應(yīng)體系需要20 μL 熒光PCR反應(yīng)液和0.5 μL Taq酶。計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積小管中，充分混合均勻后，向每個PCR管中各分裝20 μL。

（2）分別向上述PCR管中加入1.3.1（11）中制備的DNA溶液各5μL，蓋緊管蓋，500 r/min 離心30秒。

（3）將加樣后的PCR管放入熒光PCR檢測儀內(nèi)，作好標(biāo)記。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：

階段，預(yù)變性95℃/3分鐘

第二階段，95℃/15秒，52℃/10秒，60℃/35秒共45個循環(huán)。熒光收集在第二階段每次循環(huán)的60℃延伸時進行。

2 判定

2.1 結(jié)果分析條件的設(shè)定

閾值設(shè)定原則：根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整，以閾值線剛好超過陰性對照品擴增曲線的高點為準(zhǔn)。對于多通道熒光PCR儀，選定FAM(465-510)檢測通道讀取檢測結(jié)果，ABI儀器選擇FAM無熒光淬滅基團。

2.2 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

2.2.1 陰性對照無Ct值并且無擴增曲線。

2.2.2 陽性對照的Ct值應(yīng)小于等于28，并出現(xiàn)典型的擴增曲線。

2.2.3 如陰性和陽性對照不滿足以上條件，此次實驗視為無效。

2.3 結(jié)果判定

2.3.1 陰性：無Ct值，且無特征性擴增曲線，表明樣品為陰性。

2.3.2 陽性：Ct值≤38.0，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，表示樣品為陽性。

2.3.3 Ct值大于38.0，且出現(xiàn)典型的擴增曲線的樣品建議復(fù)驗。復(fù)驗仍出現(xiàn)上述結(jié)果的，判為陽性，否則判為陰性。

【注意事項】

1 實驗室應(yīng)至少分三個區(qū)：樣品處理區(qū)、反應(yīng)混合物配制區(qū)和檢測區(qū)。

2 各區(qū)物品均為，不得交叉使用，避免污染。檢測結(jié)束后，應(yīng)立即對工作臺進行清潔。

3 Buffer A有很強的腐蝕性，切勿沾到皮膚或衣服上，否則應(yīng)立即用大量清水沖洗并擦干。

4 在整個檢測過程中應(yīng)注意避免交叉污染：提取核酸時應(yīng)用滅菌的鑷子夾取離心管；對離心管開蓋時應(yīng)避免粘在手上或濺出，否則要立即更換手套。

5 反應(yīng)液在使用前要*融化，并將反應(yīng)液與Taq酶瞬時離心將液體甩至管底。分裝反應(yīng)液時，應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡。上機前注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄露污染儀器。

6 陽性對照在吸取前應(yīng)在微量漩渦振蕩器上劇烈振蕩1～2秒。

7 試劑盒中各組分應(yīng)避免反復(fù)凍融。

8 對樣品及其廢棄物的操作應(yīng)嚴(yán)格遵守生物安全規(guī)定。

9 本試劑盒僅供獸醫(yī)及相關(guān)專業(yè)人士使用。

【貯藏與有效期】  非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒的A盒室溫保存，B盒在-20℃保存，有效期為12個月。

【規(guī)格】  48檢測/盒